Test di attivazione dei basofili: applicazioni attuali e prospettive future| Rassegna di Patologia dell'Apparato Respiratorio

Abstract

Il test di attivazione basofila (BAT) è un test che valuta, in citometria a flusso, la percentuale di attivazione o degranulazione dei basofili del sangue periferico, dopo esposizione “in vitro” a specifici allergeni. Nei pazienti sensibilizzati, la stimolazione dei basofili del sangue periferico con uno specifico allergene induce o aumenta l’espressione di molecole, come CD63 e CD203c, che rappresentano rispettivamente marcatori di degranulazione e di attivazione dei basofili. La validità del BAT richiede un controllo negativo (soluzione salina sterile) e un controllo positivo (molecole anti-IgE). Numerosi studi hanno dimostrato il ruolo del BAT nel supportare la diagnosi di allergia a farmaci, alimenti e veleno di imenotteri. Il BAT ha dimostrato una scarsa sensibilità ma una buona specificità nella diagnosi di allergia a farmaci quali FANS, antibiotici beta-lattamici, chinoloni e miorilassanti. Nell’allergia alimentare, la sensibilità e la specificità del BAT dipendono dal tipo di alimento; nel caso dell’allergia alle arachidi la sensibilità può raggiungere il 96% mentre la specificità il 100%. Inoltre, il BAT è uno strumento utile per monitorare la risoluzione naturale delle manifestazioni allergiche e gli effetti clinici indotti dall’immunoterapia o dal trattamento anti-IgE. Infine, il BAT è stato utilizzato per lo studio dei meccanismi patogenetici sottostanti diverse condizioni morbose IgE-mediate. Ad esempio, nei pazienti affetti da asma bronchiale grave, il BAT ha dimostrato la capacità delle enterotossine dello Stafilococcus aureus di indurre l’attivazione dei basofili, supportando il ruolo delle enterotossine quali “trigger” della cascata infiammatoria nell’asma bronchiale. Nei pazienti affetti da Fibrosi cistica il test può essere utilizzato per discriminare l’Aspergillosi broncopolmonare allergica dalla colonizzazione da Aspergillus. Più recentemente, il BAT è stato proposto come un potenziale strumento diagnostico per valutare l’allergia al polietilenglicole (PEG) presente nel vaccino mRNA anti-SARS-CoV-2 BNT162b2.

Come funziona?

Il test di attivazione basofila (BAT) è una metodica che valuta, in citometria a flusso, la percentuale di attivazione o degranulazione dei basofili del sangue periferico, dopo esposizione “in vitro” a specifici allergeni ¹. Sebbene i basofili rappresentino meno dello 0,5% dei leucociti totali del sangue periferico e per anni siano stati considerati esclusivamente come forme circolanti di minore importanza delle mastcellule, recenti evidenze hanno dimostrato un ruolo fondamentale svolto da tali cellule nella patogenesi delle malattie allergiche e delle reazioni di ipersensibilità.

Il BAT è un “test funzionale” che mima “in vitro” il contatto tra gli allergeni e le cellule responsabili del rilascio di istamina. In questo test i basofili del sangue periferico sono dapprima esposti “in vitro” a uno specifico allergene e successivamente sottoposti ad analisi citofluorimetrica per misurare l’espressione di marker di attivazione sulla loro superficie.

I basofili vengono selezionati mediante l’utilizzo di anticorpi monoclonali rivolti verso specifici marcatori quali, ad esempio, il CCR3 (recettore per le chemochine CC di tipo 3), il CRTH2 (recettore per la prostaglandina D2 espresso da eosinofili, basofili e linfociti Th2), e il CD123 (subunità del recettore di IL3). Successivamente la risposta agli specifici stimoli allergenici viene valutata mediante l’espressione di molecole, quali il CD63 e il CD203c. Il CD63 è una proteina transmembrana della famiglia delle tetraspanine che è presente sulla superficie dei granuli intracellulari dei basofili non attivi sia dei soggetti normali sia dei soggetti allergici. Dopo esposizione a stimoli allergenici viene rapidamente espresso sulla superficie cellulare, in circa 60 secondi, per cui la sua espressione riflette la degranulazione dovuta alla fusione tra la membrana dei granuli e la membrana cellulare. Il CD203c è l’enzima ectonucleotide pirofosfatasi/fosfodiesterasi, appartenente alla famiglia delle proteine transmembrana, che opera il clivaggio di numerose molecole ma la cui funzione non è completamente definita. Il CD203c è espresso costitutivamente a basse concentrazioni sulla membrana cellulare dei basofili non attivi e viene up-regolato in seguito alla loro stimolazione. Il CD63 può, pertanto, essere definito un marker di degranulazione e il CD203c un marker di attivazione cellulare. CD63 e CD203c rappresentano differenti pathways della degranulazione basofila e sono entrambi utilizzati come marker del BAT. La validità del BAT richiede la negatività del controllo negativo (esposizione a soluzione salina sterile) e la positività del controllo positivo (esposizione a molecole anti-IgE). I risultati del BAT possono essere espressi in maniera differente. Nel caso del CD63, non espresso dai basofili “a riposo” né da altri tipi cellulari, la positività del test viene riferita in termini di percentuale di basofili che esprimono il CD63. Nel caso del CD203c, normalmente espresso sulle membrane dei basofili, ma iper-espresso sulle membrane dei basofili attivati, la positività del test viene riferita mediante l’indice di stimolazione, vale a dire il rapporto tra l’intensità media di fluorescenza (MFI) ottenuta dall’esposizione allo specifico allergene e dal controllo negativo. Il test viene considerato positivo quando l’indice di stimolazione risulta maggiore di 2 o, in alternativa, se la percentuale assoluta di basofili esprimenti CD203c dopo il contatto con lo specifico allergene sia uguale o superiore al 5%.

Qual è lo stato dell’arte?

Diversi studi di letteratura hanno dimostrato il ruolo del BAT nel supportare la diagnostica allergologica ad alimenti, farmaci e al veleno degli imenotteri ^2-4. Nell’allergia a farmaci (FANS, antibiotici beta-lattamici, chinolonici e miorilassanti) l’uso del BAT è condizionato da una scarsa sensibilità ma da una sufficiente specificità. La sensibilità del test aumenta quando viene testato un pannello di farmaci piuttosto che un singolo farmaco ⁵. Nell’allergia ad alimenti la sensibilità e la specificità del BAT variano a seconda degli alimenti; ad esempio nel caso dell’allergia alle arachidi la sensibilità raggiunge il 96% mentre la specificità raggiunge il 100% ⁵. Nell’allergia a latte vaccino e all’uovo il BAT ha una capacità predittiva negativa che si avvicina al 96% ⁵. Il vantaggio principale del test “in vitro” BAT consiste nell’evitare l’esposizione del paziente allergico ai potenziali specifici allergeni come si verifica nei “test in vivo” quali il prick by prick con l’alimento stesso, l’intradermoreazione e il test di provocazione orale che, nell’allergia alimentare resta, comunque, il “best test”. A tal proposito il BAT può essere di “ausilio” nel prevedere il rischio di reazioni gravi nel caso in cui sia necessario eseguire il test di provocazione con l’allergene specifico ². Infine, il BAT costituisce uno strumento utile nel monitoraggio dei cambiamenti dello stato allergico nel tempo sia fisiologici che conseguenti a terapie con immunomodulanti o immunoterapia specifica. In particolare, il BAT è stato utilizzato per valutare la sospensione dell’immunoterapia specifica nei pazienti con allergia agli imenotteri, per prevenire le reazioni anafilattiche ad anestetici, per consentire la reintroduzione di farmaci antineoplastici che hanno determinato reazioni di ipersensibilità e per valutare l’avvenuta desensibilizzazione nei bambini allergici a componenti del latte vaccino ^6-8.

Quali sono le prospettive di utilizzo in futuro?

Il BAT è un test che può consentire lo studio dei meccanismi patogenetici responsabili di differenti condizioni morbose IgE-mediate. Recentemente, il BAT è stato utilizzato per valutare il ruolo patogenetico svolto dalle enterotossine secrete dallo Staphylococcus aureus (S. aureus) nei pazienti affetti da asma bronchiale grave. Questo batterio, che frequentemente colonizza le vie aeree superiori, può rilasciare enterotossine che agiscono sia come superantigeni, inducendo la produzione di IgE policlonali, che come allergeni determinando la produzione di IgE specifiche. Diversi studi di letteratura hanno dimostrato un’associazione tra la presenza di IgE verso le enterotossine dello S. aureus e il rischio di sviluppare asma grave, dimostrando una correlazione positiva tra i livelli sierici delle IgE specifiche e la gravità della malattia, in termini di riacutizzazioni, ospedalizzazioni e mancato controllo dei sintomi. In questo lavoro è stata dimostrata, mediante il BAT, la capacità delle enterotossine dello S. aureus di indurre l’attivazione dei basofili in circa un terzo dei pazienti affetti da asma bronchiale grave, supportando il ruolo delle enterotossine quali “trigger” della cascata infiammatoria nell’asma bronchiale ⁹. Il BAT si è rivelato, inoltre, un test in grado di discriminare l’aspergillosi broncopolmonare allergica dalla colonizzazione da Aspergillus fumigatus nei pazienti affetti da fibrosi cistica ¹⁰.

Il BAT è stato utilizzato come potenziale strumento diagnostico per confermare l’allergia all’eccipiente polietilenglicole (PEG) presente nel vaccino anti-SARS-CoV-2 BNT162b2 mRNA. Uno studio recente ha dimostrato, nei pazienti con anamnesi di pregressa allergia al PEG, la capacità del vaccino BNT162b2, ma non del PEG nel suo stato nativo, di indurre l’attivazione dei basofili. Al contrario, la doxorubicina liposomiale PEGilata determinava l’attivazione dei basofili, suggerendo che il PEG, come modificato e disposto sulla nanoparticella lipidica del vaccino, costituisce il potenziale trigger della reazione anafilattica a BNT162b2. In aggiunta, lo studio sottolineava la carenza degli attuali protocolli dei test cutanei per l’allergia ai farmaci liposomiali PEGilati, in quanto non tutti i pazienti con anamnesi di reazioni allergiche al PEG risultavano positivi ai test cutanei con il PEG ¹¹. Inoltre, un altro studio ha dimostrato che il BAT rappresenta un potenziale strumento diagnostico per valutare l’allergia all’eccipiente PEG ma non al vaccino BNT162b2 mRNA, in quanto un risultato positivo del BAT al vaccino era presente anche nei soggetti con pregressa infezione COVID-19 ma non allergici al PEG ¹¹. È da sottolineare che il BAT, essendo un test “in vitro”, non determina la sensibilizzazione del paziente alle eventuali molecole che vengono testate.

In conclusione, molti lavori hanno dimostrato l’efficacia del BAT nella diagnostica allergologica in vitro, suggerendo le più svariate applicazioni, poiché il test si presta all’utilizzo di “qualsiasi sostanza che possa essere messa in soluzione”.

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